细胞冷冻保存常识

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细胞冷冻保存常识

更新时间：2022-01-18

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1.1.欲冷冻保存的细胞应在生长良好的指数生长期且高存活率，约为80-90%的汇合度。

1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其*性质，例如杂交瘤细胞应在冷冻保存前一至二日测

试是否有抗体之产生。

1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色。4℃避光保存，勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

1.4.冷冻保存之细胞浓度： DMSO 的浓度介于 5%~20% 之间。生长培养液的体积应调整以适于所用细胞保护剂的变化。

1.4.1.正常人成纤维细胞:1-3×106 cells/ml

1.4.2.杂交瘤细胞:1-3x106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些杂交瘤细胞会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后si去。

1.4.3.贴壁的肿瘤细胞系:5-7x106cells/ml，依细胞种类而异。腺癌解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3×106cells/ml。

1.4.4.其他悬浮细胞:5-10× 106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。

1.5.冷冻保护剂浓度为5%或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同

时，亦应作一个对照培养，以防止冷冻失败。+n6

2.细胞冷冻保存的具体操作

2.材料：

2.1.生长良好之培养细胞

2.2.新鲜培养基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.无菌塑料冷冻保存管

2.5.0.4％ w/v台盼蓝

2.6.血球计数盘与盖玻片

2.7.等速降温机(KRYO10SeriesII)

3.步骤：

3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

3.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，

混合均匀，置于室温下待用。

3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约20ul)计数细胞浓

度及冻前存活率。

3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，对应细胞适合的冻存密度混合均匀，分装于已标示*之冷冻保存管中，1ml/管，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

3.5.冷冻保存方法：在每一个冻存管上注明细胞系的名字，冻存者姓名和冻存时间，方便日后寻找。将一批细胞用橡皮筋捆绑住，用足够多的棉花将冻存管包裹，包括烧杯的底座和瓶顶，保护细胞逐级冷却，防止过快冷冻产生的冰晶破坏细胞状态，放入-80℃冷冻，然后放置于液氮中。