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养细胞是一件戳心戳肺的事情，你要像照顾小孩一样仔细对待，爱护她，呵护她。

细胞培养前的准备

在您带上手套开始细胞培养之前,先检查一下移液管和瓶子的数量是否充足,以免在开始实验后再次出入操作台，这样可以降低细胞污染的风险。

细胞培养基也应先预热,选择只预热部分培养基而非整瓶加热,不但可以节约实验时间,而且可以避免因反复加热培养基而造成的蛋白质降解。

结束操作后,别忘了培养基对光敏感,应尽可能避光保存。

细胞培养的定期检查，定期检查培养细胞的形态，即形状和外观，对于细胞培养实验取得成功至关重要。

除确认细胞的健康状态外，每次操作细胞时通过肉眼和显微镜检查细胞还可早期发现污染征象，避免污染扩散至实验室其他细胞。

细胞变质的征象包括核周出现颗粒、细胞与基质解离以及细胞质空泡形成。

这些变质征象可能为多种原因所致，例如：培养物污染、细胞系衰老或培养基中存在毒性物质，或者这些征象仅表明培养物需要更换培养基。

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一、传代培养（消化法）

1、预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

2、用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手，严格进行无菌操作前的准备工作。

3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

4、点燃酒精灯：注意火焰适宜。

5、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

6、从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

7、打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

注意事项：严格的无菌操作过程

二、胰蛋白酶消化

1、加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞zui好，zui佳消化温度是37℃。

2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

3、吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

注意事项：

适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

三、吹打分散细胞

1、吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

2、吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。

3、平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。

4、弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

四、分装稀释细胞

1、分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×10^5/ml。zui后要做好标记。

五、继续培养

用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋

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一、准备工作

1、将水浴锅预热至37℃

2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

二、取出冻存管

1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

三、迅速解冻

1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2、约1-2min后冻存管内液体*溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

四、制备细胞重悬液

1、离心（3000rpm,3min)后吸弃上清液。

2、向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。

五、细胞计数

细胞浓度以5×10⁵/ml为宜。

六、细胞培养

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。

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 当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

一、准备工作

取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。

二、细胞悬液制备细胞悬液制备

细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

三、细胞计数

1、盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2、制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3、将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。

5、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子细胞数/4) ×2×104

说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。

公式中乘以10^4因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm³ 而 1ml＝1000mm³

四、细胞计数要点

1、进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于10⁴个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；

2、要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

3、取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

4、数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5、操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

只要满足以下两个条件就可以进行细胞活力检测，正常细胞的细胞膜是完整的。

Propidium iodide（PI碘化丙啶）是一种核酸染料，常用于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的检测和流式细胞仪分析。PI不能通过正常完整的细胞膜，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色，可以用来分辨坏死细胞/正常细胞。

加入另一种可以透过细胞膜的核酸染料，就可以通过两种染料将活细胞和死细胞区分开。

PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。