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★CQ★上海蒂科生物专注生物科研试剂：胎牛血清FBS（HAKATA、HyClone、SERANA、NTC、Corning、BOVOGEN、PAA、SIGMA等），无外泌体血清(SBI)，ELISA试剂盒（HAKATA自主品牌、进口），2万多株细胞（含400多种类通过STR鉴定），培养基（干粉、液体），双抗，胰酶，sigma试剂等。本公司优质供应原装正品胎牛血清，*的服务、真诚的态度、坚持以质取胜，做您的实验专家。

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★CQ★现象描述:

我昨天早上传的代，晚上看还是好好的，培养基颜色正常，今天早上9点钟左右，培养基就变浑浊了，显微镜下观察细胞好多都已经漂起来了，明显是污染了，但我的培养液里明明加了双抗了啊？

这个问题等同于，

明明有免疫系统的我们

为什么还是感冒了呢

★CQ★解答一

>> 加双抗只是有一定的预防作用，但不能避免污染

现在很多细菌对双抗都有耐药性，所以加了也不一定就能杀死；双抗的保存方式的问题，青霉素在37℃下很快就会分解掉；污染的细菌是不是在抗菌谱中；如果是真菌的话双抗就没有什么卵用的；

★CQ★解答二

>> 养细胞要从源头做起，杜绝各种污染

刚买来的或借来的细胞株，一般都会在培养基中添加抗生素，待通过污染测试后，大量培养时则不要加抗生素；

还有就是无血清培养时建议zuihao不加双抗，因为没有血清的保护，细胞此时是比较脆弱的，很容易受到双抗的毒副作用影响。

加双抗并不是*除菌的方法。要防止污染除了使用双抗，还要注意污染源大多来自换液和消化时的操作不正规，如果你在处理细胞得操作过程不规范，即便加入双抗也很难避免污染。就像抵抗力再强的汉纸，如果任由自己在寒风中、雨雪天气里任性，像一颗海草随风飘摇的话，终有崩溃的一天。所以保证细胞处理过程或培养基配制过程中的无菌操作才是关键。

★CQ★解答三

>> 不是所有的细胞污染都用相同的解决办法

很多实验室在遇到细胞污染，准确的说是怀疑细胞受到污染（原因不明导致的细胞状态不好）时，都会选择一种处理方式——扔掉！害怕他会传染到其他的细胞，但是往往你们扔掉的是“受害者”，而没找到“真凶”。

并不是所有的细胞污染都能用扔掉解决，也并不是所有的细胞污染都可以用同一种试剂解决。

辨别细胞状态，找到根源，“对症下药”才是关键。

（1）细菌污染 

状态：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 

解决方法： 

1.仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间和压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要检查培养液是否存在浑浊现象！ 

2.可在培养液或血清中加支原体预防剂，以及的细菌清除剂。 

（2）霉菌及真菌污染 

状态：肉眼观察培养基，发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌，显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。 

解决方法： 

1.保证细胞房的干净整洁，干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。 

2.控制外来人员进出实验室。 

3.对实验室及培养箱进行*消毒，推荐使用专门针对细胞培养环境的抑菌剂。 

4.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作。 

悬浮细胞：收集细胞并离心，用PBS漂洗，重复此操作数次。贴壁细胞：用PBS轻轻冲洗细胞，重复此操作数次。加入杀灭真菌

（3）支原体感染 

状态：显微镜下很难捕捉，培养液一般不会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中zui常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是生长缓慢，直至慢慢凋亡。 

解决方法： 

>>预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测，向培养基中添加支原体预防剂。 

>>补救：将支原体去除剂与*培养液按1:800～1000比例稀释，加入细胞正常培养；并根据细胞污染的严重程度，处理3～6次即可*清除细胞支原体污染问题。 

（4）黑胶虫污染 

状态：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。常常可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

解决方法：

加入黑胶虫去除剂，改变培养基的品牌。血清冻融采取逐级冻融等方法。

（5）杆菌污染

状态：类芽孢杆菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈杆状，革兰氏染色阳性、阴性或可变，以周生鞭毛运动。当细胞出现类芽孢杆菌污染，会在显微镜下看到一些杆状游动的小虫子.

解决方法：

a. 发现细胞有杆菌污染，弃掉培养基，用PBS清洗3遍；

b. 然后按1:2000 比例加入类芽孢杆菌去除剂，即：边加边摇匀；

c. 每天处理一次，类芽孢杆菌去除剂连续处理3-4天，即可*清除杆菌污染。

除以上污染源外，配液消毒问题、操作问题也是污染原因之一。关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37℃试培养一段时间后观察，如果没有细菌生长就是操作及细胞培养箱环境的问题。

★CQ★细胞培养，尤其是细胞系的培养，就细胞消化而言，多做、善于总结，就可以把细胞养的越来越好。

★CQ★绝大部分细胞消化只要用胰酶润洗一遍即可：

吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把细胞全部消化成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了。

一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。

细胞就是*成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，你可以尝试，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。

一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液。细胞只要能从基质上脱离下来，即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右）是正常的，不要再去延长消化时间，等待单细胞悬液出现。

★CQ★比较难消化的细胞：

润洗方法5min还不能消化，以结肠癌细胞为例，比如HCT15、LS411和KM12细胞，胰酶消化，一般10 cm 培养皿，一次zui多加入300ul-500ul就足够了。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。

★CQ★常规的细胞实验，受消化影响不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外）。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态要求*。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响细胞外基质相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

许多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA联合作用。这里要明白，胰酶切割细胞外基质的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca离子，作用于整联蛋白的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果10min还消化不*的话），而应该想其它办法。

★CQ★PBS洗涤：

消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为血清中含有抑制胰酶的蛋白。对于一些难消化细胞，可以配制不含Ca，Mg离子的PBS，因为这些离子也会抑制胰酶的活性。但对于绝大部分细胞用胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化，不需要配制不含Ca，Mg离子的溶液。

每段时间定期对细胞房、培养箱&水盘、水浴锅、废液桶等容易染菌的个角落细菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好细胞房，带好手套、口罩、鞋套，防止人为因素污染。一旦发现污染，及时处理。

★CQ★细胞培养，尤其是细胞系的培养，就细胞消化而言，多做、善于总结，就可以把细胞养的越来越好。

★CQ★绝大部分细胞消化只要用胰酶润洗一遍即可：

吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把细胞全部消化成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了。

一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。

细胞就是*成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，你可以尝试，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。

一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液。细胞只要能从基质上脱离下来，即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右）是正常的，不要再去延长消化时间，等待单细胞悬液出现。

★CQ★比较难消化的细胞：

润洗方法5min还不能消化，以结肠癌细胞为例，比如HCT15、LS411和KM12细胞，胰酶消化，一般10 cm 培养皿，一次zui多加入300ul-500ul就足够了。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。

★CQ★常规的细胞实验，受消化影响不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外）。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态要求*。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响细胞外基质相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

许多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA联合作用。这里要明白，胰酶切割细胞外基质的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca离子，作用于整联蛋白的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果10min还消化不*的话），而应该想其它办法。

★CQ★PBS洗涤：

消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为血清中含有抑制胰酶的蛋白。对于一些难消化细胞，可以配制不含Ca，Mg离子的PBS，因为这些离子也会抑制胰酶的活性。但对于绝大部分细胞用胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化，不需要配制不含Ca，Mg离子的溶液。

每段时间定期对细胞房、培养箱&水盘、水浴锅、废液桶等容易染菌的个角落细菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好细胞房，带好手套、口罩、鞋套，防止人为因素污染。一旦发现污染，及时处理。

★CQ★解答一

>> 加双抗只是有一定的预防作用，但不能避免污染

现在很多细菌对双抗都有耐药性，所以加了也不一定就能杀死；双抗的保存方式的问题，青霉素在37℃下很快就会分解掉；污染的细菌是不是在抗菌谱中；如果是真菌的话双抗就没有什么卵用的；

★CQ★解答二

>> 养细胞要从源头做起，杜绝各种污染

刚买来的或借来的细胞株，一般都会在培养基中添加抗生素，待通过污染测试后，大量培养时则不要加抗生素；

还有就是无血清培养时建议zuihao不加双抗，因为没有血清的保护，细胞此时是比较脆弱的，很容易受到双抗的毒副作用影响。

加双抗并不是*除菌的方法。要防止污染除了使用双抗，还要注意污染源大多来自换液和消化时的操作不正规，如果你在处理细胞得操作过程不规范，即便加入双抗也很难避免污染。就像抵抗力再强的汉纸，如果任由自己在寒风中、雨雪天气里任性，像一颗海草随风飘摇的话，终有崩溃的一天。所以保证细胞处理过程或培养基配制过程中的无菌操作才是关键。

★CQ★解答三

>> 不是所有的细胞污染都用相同的解决办法

很多实验室在遇到细胞污染，准确的说是怀疑细胞受到污染（原因不明导致的细胞状态不好）时，都会选择一种处理方式——扔掉！害怕他会传染到其他的细胞，但是往往你们扔掉的是“受害者”，而没找到“真凶”。

并不是所有的细胞污染都能用扔掉解决，也并不是所有的细胞污染都可以用同一种试剂解决。

辨别细胞状态，找到根源，“对症下药”才是关键。

（1）细菌污染 

状态：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 

解决方法： 

1.仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间和压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要检查培养液是否存在浑浊现象！ 

2.可在培养液或血清中加支原体预防剂，以及的细菌清除剂。 

（2）霉菌及真菌污染 

状态：肉眼观察培养基，发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌，显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。 

解决方法： 

1.保证细胞房的干净整洁，干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。 

2.控制外来人员进出实验室。 

3.对实验室及培养箱进行*消毒，推荐使用专门针对细胞培养环境的抑菌剂。 

4.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作。 

悬浮细胞：收集细胞并离心，用PBS漂洗，重复此操作数次。贴壁细胞：用PBS轻轻冲洗细胞，重复此操作数次。加入杀灭真菌

（3）支原体感染 

状态：显微镜下很难捕捉，培养液一般不会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中zui常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是生长缓慢，直至慢慢凋亡。 

解决方法： 

>>预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测，向培养基中添加支原体预防剂。 

>>补救：将支原体去除剂与*培养液按1:800～1000比例稀释，加入细胞正常培养；并根据细胞污染的严重程度，处理3～6次即可*清除细胞支原体污染问题。 

（4）黑胶虫污染 

状态：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。常常可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

解决方法：

加入黑胶虫去除剂，改变培养基的品牌。血清冻融采取逐级冻融等方法。

（5）杆菌污染

状态：类芽孢杆菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈杆状，革兰氏染色阳性、阴性或可变，以周生鞭毛运动。当细胞出现类芽孢杆菌污染，会在显微镜下看到一些杆状游动的小虫子.

解决方法：

a. 发现细胞有杆菌污染，弃掉培养基，用PBS清洗3遍；

b. 然后按1:2000 比例加入类芽孢杆菌去除剂，即：边加边摇匀；

c. 每天处理一次，类芽孢杆菌去除剂连续处理3-4天，即可*清除杆菌污染。

除以上污染源外，配液消毒问题、操作问题也是污染原因之一。关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37℃试培养一段时间后观察，如果没有细菌生长就是操作及细胞培养箱环境的问题。 

★CQ★TIPs：细胞操作及细胞培养箱环境问题如何解决？ 

1、提高细胞操作技巧，禁止交叉使用枪头，在酒精灯火焰5公分距离内操作。 

2、定期对细胞培养箱消毒，培养箱水盘中的水也要定期更换，并使用无菌水。 

3、进入细胞房之前及在无菌操作台操作细胞实验之前需使用紫外灯照射30min。定期使用细胞房除菌剂对细胞房空间进行处理。

4、每次开培养箱之前需用酒精消毒双手。 

5、用培养箱除菌剂和水盘抑菌剂定期对培养箱进行消毒。 

6、配制的培养基需验证无菌后方可进行细胞培养。