HAKATA 透析型胎牛血清 【产品特性】

1、内毒素含量低，三次纳米级过滤

2、严格控制批次差异

3、来源可靠、可溯源

4、每个批次提供相应检验检疫报告

5、适合各种常规细胞培养

6、干冰运输，建议存储温度为-20℃至-10℃

HAKATA 透析型胎牛血清 真正行货通常作为补充成分添加在基础培养基内使用。它能够提供各种大分子蛋白，小分子量营养，水溶性成分的转运蛋白，和其它一些细胞在体外所必需的成分，如激素和附着因子。血清可以结合或中和一些生长因子中的有毒成分，并提供培养基的缓冲能力。细胞培养时血清的添加依赖于基础培养基的化学组成，培养细胞的类型，及所用的培养系统。

我们在提供细胞培养基、平衡盐溶液、无血清培养基和试剂的同时，还提供高品质的血清。我们对血清制备进行全过程监管。从血清收集到zui终产品检验和内部稽核的每一个步骤，我们都采用设备和标准操作程序，以确保整个过程中每个环节的产品质量。对整个过程的控制可以保证产品的持续高品质，降低不同批次的差异。

处理：全部血清：收集的血液均在冷藏条件下处理。血清和血分离后立即将血清合并并冷冻。只有符合我们的检测标准的血清才被接受作进一步处理。

热灭活血清：热灭活是在56℃水浴中严格控温30分钟。透析血清：用10,000截留分子量的透析膜在0.15M的NaCl中进行透析，直到葡萄糖水平低于5mg/dl(用邻甲苯胺测试法检验)。γ射线照射血清：可按客户要求对血清进行γ射线照射。通过γ射线照射以灭活各种动物血清(包括胎牛血清、新生牛血清、猪血清和马血清)中的病毒和支原体的方法已经得到证实。研究证实照射剂量在30-45kGy为宜。血清在此照射后物理化学特性和细胞培养表现没有变化。装瓶：粗血清须通过一系列的过滤才成为成品。zui后的过滤步骤包括使用0.2um和0.1um的无菌过滤。胎牛血清须通过三次0.1um过滤，其他血清须通过0.2um过滤。zui终产品的质量控制：我们采取以下方法对每一批次的产品选取一定数量的样品进行质量控制分析：

化学检测：使用低温凝固点的方法检测渗透压，以保证符合产品规范。我们每天使用国家标准的技术研究所标定的标准溶液对我们的渗透压检测仪器进行校准。同样每天使用国家标准技术研究所标定的标准溶液对pH计进行校准。

使用电泳图谱鉴定血清的整体性质。样品被转移到硝酸纤维素基质中，并在缓冲体系内迁移。条带经染色、清洁、干燥后用密度仪进行扫描，以检测白蛋白和球蛋白组分的相对浓度。为证实是否在适当的条件下进行采血和处理，使用修饰的Fleming方法对血红蛋白进行分光光度检测。

随着动物年龄的增加，血清总蛋白含量也相应地提高。使用自动化的Biuret方法进行总血清蛋白的检测，以确认动物年龄并验证符合产品规范。使用色度计在不同波长下检测样品和Biuret试剂混合波的吸光度。自动计算结果后，与标准曲线比较，即可得到蛋白值(克/公升)。

稳定性检测程序：在每一个标记为体外诊断的产品上显示的效期表明了这个产品具有多长时间的效能。我们的稳定性程序确定和证明了产品效期。我们定期监测批量产品，确定产品在推荐贮存条件下具有可接受效果的时间长度。

微生物学检测：所有血清使用Barile&Kern的大体积方法检测支原体。在推荐方法的检测范围内检测结果是准确的。样品至少应该在肉汤中合并培养3个星期，同时要在琼脂平板上进行不少于4次传代培养。在有氧和厌氧(95%氮，5%CO2)条件下，平板在36±2℃下孵育。在检测过程中，每周对琼脂平板进行一次微生物生长情况检验。使用Dienes染色法对怀疑被污染的琼脂平板进行支原体菌落的检测。然后，对平板进行再次镜检。对孵育肉汤瓶要定期进行浊度和pH值变动的检测。在推荐方法检测范围内，所有血清也要使用Hoechst荧光DNA染色法进行不可在肉汤中培养的支原体(包括M.hyorhinis属)检测。

病毒检测：已知无外来物质的细胞培养基须经过在包含15%测试血清的生长培养基中进行为期21天的三次传代培养。使用对照培养基和已知对外来物质为阴性的血清平行地维持阴性对照培养。整个期间，检测所有的培养情况，以便发现是否存在病毒诱发的细胞形态改变或致细胞病变效应。在14至21天的培养期间，对含有检测血清的平行培养瓶按下面标准病毒检测方法进行评估。

将其中一瓶检测细胞用胰蛋白酶消化，然后把细胞分别加入到总面积为6cm 2 的六室载玻片上。同时准备阴性对照载玻片。在检测培养的单室载玻片上加入牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛细小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠病毒的染色剂，作为单个的阳性对照。再经过7天培养(总共21天)，利用荧光抗体技术检测病毒。

通过对检测培养进行苏木精伊红染色，观察致细胞突变效应(CPE)或其他病毒诱导效应。检测细胞是否存在CPE效应、内含物、多核体或其他异常效应。

内毒素检测：我们用阿米巴变形细胞溶解物(LAL)凝胶法来检测胎牛血清的内毒素含量。

效能检测：
对每一批次的胎牛血清，我们都进行下述培养效能检测。选择血清zui重要的标准是其支持特殊细胞的生长能力。因此，除了保证血清通过严格的品质控制，我们也同时在实验室条件下对血清的三个重要的培养效能进行检测：克隆效率、贴壁效果和二倍体成纤维细胞生长促进。

克隆效率分析：克隆效率实验分析每一批胎牛血清促进小鼠骨髓瘤细胞及其衍生的杂交瘤细胞的克隆和生长能力。下列产品
经验证可用于该实验：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一批胎牛血清都要分别在复制微量滴定平板上加入两种血清浓度和两种细胞接种量(10%血清和1cell/孔，4%血清和5cells/孔)的情况下进行分析。克隆分析结果除以已确定的参照血清值得以归一化。在许多日常杂交选择程序中具有代表性的是高浓度的血清，而低浓度血清在设计血清批次细微差异放大检测中有更为严格的测试。严格的1cell/孔测试是模拟单一杂交选择的实验室条件。为每一批次胎牛血清提供的分析证明报告中的克隆效率值为两次测试条件下的平均值。

克隆分析法：克隆分析法是在复式96孔板中加入两种胎牛血清浓度(10%v/v)和(4%v/v)和两种接种量的情况下进行的。每一次化验中，同时测量前期已验证合格的一批胎牛血清，并将此测量值作为内部参考标准。
克隆分析按下述方法进行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在含有10%的胎牛血清的RPM1640中通常保持对数生长期。在显微镜下，利用台盼蓝排除法对活细胞进行计数。

2．用RPM1640培养基将储备细胞悬浮液进行连续稀释，使其达到预期的25cells/ml和5cells/ml接种浓度。准备含有参照或测试胎牛血清的RPM1640培养基。将这种密度的细胞分配到各个分析生长培养基体积为0.2毫升的孔中，使其分别平均含有5个和1个细胞。

3．将96孔板放入36±2℃，4-6% CO 2 的潮湿培养箱孵育约10至15天。

4．在孵育期间，用肉眼观察平板并对用于克隆的孔进行计数。克隆效率按下列方法计算：克隆效率=(阳性孔平均数/孵育孔总数)×100%

5．每一批次胎牛血清维持指示剂骨髓瘤细胞克隆效率的定量按照以下方法测得的相对克隆效率(RCE)进行归一化：RCE=检测血清的克隆效率/对照血清的克隆效率贴壁效率分析：贴壁效率分析是利用已转型的人类细胞系来检测每一批血清促使持续贴附细胞系的生长能力。选择已被验证可以检测贴壁效率的细胞系A549(人肺肿瘤细胞，ATCC#CCL,185)，是因为它可以区分一批血清维持细胞贴壁和繁殖能力的细微差异。

每一批次胎牛血清都要在两种血清浓度和两种细胞接种浓度下(10%血清和100cells/孔，4%血清和200cells/孔)测试三次。在36±2℃，4-6% CO 2 的潮湿培养箱孵育约10至14天，对被染色的细胞菌落进行计数即可得到其贴壁效率。将结果除以参考的对照血清得以归一化。通过两种血清浓度的测试，可以验证该批次血清在减量和标准水平下维持生长的能力。为每一批次胎牛血清提供的分析证明报告中的贴壁效率值为两次测试条件下的平均值。

贴壁分析法：使用贴附分析检测上述每一批测试血清。这种分析法针对每一个血清样品使用一个6孔板(每室9.6cm 2 )，并可以对三个孔的数据进行平均处理。每一次化验中，同时测量前期已验证合格的一批胎牛血清，并将此测量值作为内部参考标准。

贴附分析按下述方法进行：

1．A549细胞系用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在36±2℃，以亚融合密度下进行培养。

2．含10%(v/v)和4%(v/v)血清的DMEM由分别在22.5毫升和24毫升DMEM中加入2.5毫升和1毫升胎牛血清配制而成，zui终有效体积为25毫升。将5毫升含血清培养基分别加入6孔板的每一个孔中。

3．A549培养细胞先经过胰蛋白酶消化，测定活细胞数，然后稀释细胞悬浮液至2,000cells/ml。

4．将0.1毫升细胞悬浮液加入200cells/孔室中，0.05毫升悬浮液加入100cells/孔室中。平板混合后放入36±2℃，5%CO 2 的潮湿培养箱孵育约10至14天。

5．孵育后，取出平板，去除生长培养基，用亚甲基兰-甲醇溶液对菌落进行染色。

6．计算菌落形成，然后按下述方法计算贴壁效率：%贴壁效率=每孔菌落平均数/每孔孵育活细胞平均数×100

7．为方便比较，将测得的贴壁效率数值除以每批检测血清的相对贴壁效率(RPE)得以归一化：RCE=检测血清的贴壁效率/参照血清的贴壁效率二倍体成纤维细胞生长：促进生长分析用于检测每一批胎牛血清维持难培养的人二倍体成纤维细胞长期生长的能力。

下列细胞系经认证可用于该实验：

WI-38(人二倍体肺成纤维细胞，ATCC#CCL 75)

WI-38细胞在含5%胎牛血清的低密度(2X10 5 /瓶)复式25-cm 2瓶中孵育，并进行为期三个连续7天的传代培养。在每一个培养期，细胞都从初始孵育密度开始传代培养。压力分层率、成倍繁殖数量和减量血清浓度是每批次促进难培养二倍体细胞的生长血清的严格测试指标。通过连续三代培养以减少前一次生长培养基的残留影响，从而保证得到检测批促进生长能力的真实结果。为每一批次胎牛血清提供的分析证明报告为第三次传代培养每复式培养瓶细胞数的平均值。将检测值除以参考对照值得以归一化。

二倍体成纤维细胞生长分析法：培养数代WI-38人类二倍体肺成纤维细胞，计算每一代的细胞总数。此项检测所挑选出的胎牛血清批号能维持难以生长细胞、贴壁性细胞、正常的细胞株生长及存活。

1．准备含5%检测血清或已验证合格的参照血清生长培养基，基础生长培养基为含L-谷氨酰胺的HBME：EBME(1：1)。按要求，在每一次流量变化和分析过程中进行传代培养时需配制含5%血清生长的培养基。

2．在低代培养水平时，将2X10 5 WI-38细胞加入各个含9.5毫升生长培养基的复式25-cm 2 培养基中。在不拧紧瓶盖的情况下，将培养瓶放入4-6%CO 2， 36℃±2℃环境中，保持24小时。然后拧紧瓶盖，将培养瓶放在36℃±2℃下孵育7天，在第2天或第3天全部更换培养基。

3．在第7天，用胰蛋白酶对每一个含参照或检测血清的复式瓶中的细胞进行消化得到一定数量细胞，然后合并并计数。将2x10 5 WI-38细胞加入含有新鲜生长培养基(已加入了与上一代同一批次的参照或检测胎牛血清)的新的复式25-cm 2 瓶中，进行细胞传代培养。按第2步所述，将培养瓶进行平衡并孵育。

4．如上所述经过三代连续分析，在每一代结束时计算每一批参照或检测血清的每瓶细胞平均数。zui后一代培养的各批检测血清实验中的相对生长率(RGR)作为参照血清实验中获得的细胞生长率分子：

%RGR=检测血清实验中每瓶平均细胞数/参照血清实验中每瓶平均细胞数X100S f9细胞生长促进分析。通过昆虫分析可以保证您购买的胎牛血清批次可以维持S f9细胞的生长。收到产品后，您需要做的就是混匀血清，在56℃下热灭活30分钟。这种分析法也可以用于乳白蛋白水解产品、酵母和其它生长辅料作为原料的生物效能分析。该分析法的准确性取决于是否用常规的细胞培养方案进行培养。用台盼蓝染色排除法测得的细胞活性至少不低于80%。

细胞生长分析法。

1．使用含10%检测或参照热灭活胎牛血清的已验证的Grace昆明培养基配制*检测培养基。

2．将储备Sf9细胞加入50毫升离心管中，在50Xg下离心5分钟。然后将每支试管的沉淀物重新用含10%的检测或参照热灭活胎牛血清*培养基配制成悬浮液。

3．反试管颠倒几次，然后每支试管倒出1毫升样品。用台盼蓝染色排除进行活细胞计数。

4．如果活性≥80%，把试管再颠倒几次并取出0.25毫升样品。然后用Coulter计数器进行细胞计数。

5．将细胞加入Erlenmeyer瓶中，使其zui终细胞浓度为2.75X10 5 cells/ml。孵育后，再一次进行细胞计数，以保证细胞密度为2.5X10 5 至3.0X10 5 cells/ml。

6．将培养瓶放到摇床上，在27℃±1℃、80-90rpm条件下孵育96小时。

7．从每一培养瓶中分别取出0.25毫升样品，用Coulter计数器进行计数。同时取出一定量的样品进行细胞活性检测。

8．将检测细胞密度与参照细胞密度相比即可得到相对细胞密度(RCN)。

噬菌体检测:我们利用溶菌斑分析法来检测是否存在噬菌体。从每一批血清中取具代表性的样品加入胰蛋白酶磷酸琼脂中，并在其加入含有噬菌体敏感的大肠杆菌悬浮液(C-3000或K-12)。然后，混合物会在胰蛋白酶磷酸琼脂平板上分层，在36±2℃环境下孵育约24小时后，观察平板上溶菌斑的形态。

生化特征检测。