A172细胞,A172细胞株的冻存与复苏
产品名称:A172细胞
规 格:1~3*106细胞/25cm2培养瓶
为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑,考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异,有时因寄赠、交换和购买,培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室,*的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70℃~-196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均己停止,即代谢处于*停止状态,故可以长期保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内,水晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。
一、细胞的冻存:为避免污染造成的损失,zui小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化,需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前,细胞应该特性化并检查是否污染。
有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基,成分可能如下:
包含10%甘油的*培养基,
包含10%二甲基亚砜(DMSO)的*培养基,
50% 细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基,或
50% 细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。
对于无血清培养基,一些普通的培养基成分可能是:
50% 细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基,或
包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。
1、悬浮细胞
计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200~400g离心5分钟沉淀细胞,使用移液管移去上清到zui小体积,不要搅乱细胞。
以1×107到5×107细胞/ml密度,在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞,或者以0.5×107到1×1027在无血清培养基中,再次悬浮细胞。
分装进冻存管,将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中,5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻,可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后转移到液氮中贮存。
2、贴壁细胞
使用分离试剂从基层分离细胞,分离时尽可能温和,使对细胞的损伤减少到zui小。
在*生长培养基中,再次悬浮分离细胞,确定有活力细胞数。
以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到zui小体积,不要搅乱细胞。
以5×106到1×106细胞/ml密度,在冻存液中悬浮细胞。
分装进冻存管,将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中,5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻,可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后转移到液氮中贮存。
二、冻存细胞的复苏:冻存细胞较脆弱,要轻柔操作。冻存细胞要快速融化,并直接加入*生长培养基中。若细胞对冻存剂(DMSO或甘油)敏感,离心去除冻存培养基,然后加入*生长培养基中。
1、直接铺板方法
取出贮存细胞,37℃水浴中快速融化。
直接用*生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml*生长培养基。进行活细胞计数,细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。培养细胞12到24小时,更换新鲜的*生长培养基,去除冻存剂。
2、离心方法
取出贮存细胞,37℃水浴中快速融化。
把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml*生长培养基,轻轻混匀。
以大约80x g离心2到3分钟。
弃去上清。
在*生长培养基轻轻再次悬浮细胞,并且进行活细胞计数。
细胞铺板,细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。