1.吸除培养瓶内旧培养液。

       2.加入无菌pbs洗液（5-8mL）轻轻润湿细胞，稀释多余的培养基，之后吸走洗液，动作要轻，不可吹打到细胞。

       3.向瓶内加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少许，以能覆满瓶底为限。

       4.置温箱中2~5分钟，一旦镜检发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，细胞变圆，比较松动后，立即终止消化。

       5.加入该细胞对应的培养基6mL（T25培养瓶）或12mL（T75培养瓶）终止消化。

       6.用吸管通过吸取的培养基轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时应尽量以zui少的次数将细胞从壁上吹下，不仅要控制吹打的力度、次数，还要注意要将细胞尽可能吹成单个。这样既能减少死细胞，又能便于细胞再次均匀贴壁生长。

       7.依据传代比例，将细胞悬液分瓶，再补充培养基后，静置于温箱培养，直止贴壁。

        贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。对于贴壁不太紧的细胞如293，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。

        胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性影响较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、解冻后存放时间及温度等)、消化时的温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶会比不含的消化能力强很多，不同细胞对消化液的敏感性也不同，比如HEP-G2人肝癌细胞，该细胞消化时间可长达10分钟左右。 消化时间仔细去摸索一下，每过2分钟镜下观察细胞是否变圆，记录*消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

        对于悬浮细胞换液时只需要补液就行。

        悬浮细胞的传代则不需要用胰酶消化，直接通过计数算好传代的比例，直接分瓶，补液。有些悬浮细胞趋于成团生长，此时细胞生长状态良好，当补液时，避免吹打。典型实例：jurkat就是成团生长。当jurkat细胞密度比较大时，可将培养瓶竖直放置2分钟左右，待大部分细胞沉下，吸走上层清液，补充等量的新鲜培养基。而HL-60就不一样了，为悬浮单个生长，如果发现该细胞包团，说明细胞状态不好，不加以正确的处理，zui终会发生凋亡
。