细胞培养的基本原理：细胞传代（生存空间和营养不足，长得太密，代谢废物太多，要洗洗，同时也要分离出一部分细胞，要加入新的培养液），换液（生存空间和营养剩余，但是代谢废物太多，要洗洗，要吃饭，才能长好，所以要洗和加入新鲜培养基），冻存（太多了，先存起来，液氮里面里就是低温，保存能量，活得久），复苏（解冻，恢复吃饭的能力，恢复生长。）这四步。

细胞培养的基本步骤（一定要明白每个步骤的意义和目的）：

01细胞传代（贴壁细胞）：

试剂：PBS,胰酶，含血清的培养基；

流程：显微镜下看一看培养皿里的细胞多不多，太多（80%~90%）会导致代谢废物很多，先吸掉废液，再用PBS洗一洗，同时太多会导致细胞黏在一起，这时候就需要加点胰酶消除它们之间的粘性，是否消除完，在显微镜下看一看，看完加入适宜的含血清的培养基，中和一下胰酶，这叫吹打，除此之外，细胞太多了，把一部分细胞移出来，加入适量的培养基放入孵箱继续培养，这叫传代。

02细胞换液：

试剂：PBS，含血清的培养基；

流程：先吸掉代谢废物（即细胞瓶中的培养液），再用PBS洗一洗，由于细胞长得不是很多，细胞之间没有黏在一起，因此不需要加入胰酶来消除它们之间的粘性。由于细胞要吃饭，加入新鲜的含血清的培养基，最后放到孵箱里面进行培养。

03细胞冻存：

试剂：冻存液，PBS，胰酶，含血清的培养基；

流程：要冻存，先配置冻存液，冻存液包含了：DMSO：防止在低温（零度以下至-196℃）保存细胞时，细胞内液会形成冰晶，渗透压会发生改变，细胞结构会出现紊乱，会导致细胞出现损伤。冻存液制备时，一般需与血清一起配置：因为两者互融时，会散发热量，所以冻存液需提前制备。

因为细胞太多了，需要冻存，所以要先看一看，吸一吸，洗一洗，分一分，中和一下，吹打制成细胞悬液，离心，吸掉上清液，加入冻存液，轻轻吹吸均匀，每管等量1ml装入冻存管，4℃20min,-20℃30min,-80℃过夜，最后放入液氮罐。

04细胞复苏：

试剂：含血清的培养基；

流程：从液氮中取出冻存管，迅速（小于3min）置于37℃水浴锅中，解冻时，边晃动边观察，当看到只有一小块冰存在时，即可从水浴锅中取出，打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀，1000r/min,离心五分钟，吸掉上清液，沉淀中加入适量培养液，放入孵箱中，培养。还有就是：复苏的细胞，需要在24小时后，换一次培养液。