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ELISA实验出现“花板”怎么解决?
更新时间:2022-09-20      阅读:990

酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)于1971年分别由瑞典学者和荷兰学者报道,开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。其原理是抗原或抗体的固相化及抗原抗体的酶标记。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。该实验因其灵敏度较高,特异性较好,操作较简单,可大批量操作而广泛应用于多种传染性疾病的筛查工作中。然而,“花板"现象的出现,往往会给实验者判读结果带来麻烦。所谓“花板",就是空白、阴性、阳性对照及室内质控孔结果正常,而标本孔的OD值却偏高,弱阳性结果较多。现对“花板"现象进行了分析和总结,认为花板原因大多在样品,解决办法主要在洗涤,孵育和显色过程也会导致。

一、 花板原因大多在样品

所谓“花板",就是空白、阴阳性对照及室内质控孔结果正常,而标本孔的OD值却偏高。之所以空白、对照及质控结果正常而标本孔异常,是因为样品本身的原因,大部分或全部标本孔的OD值偏高,很可能是因为样品中某些共有的物质非特异性的吸附于固相载体,而在实验的过程中未被除去。

1、待测血清中混有红细胞或纤维蛋白原 这两种物质易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净,李文,卓玛等人[1,2]实验表明在较高的离心转速(3000 /min)和较长的离心时间(>10 min)之下,血液标本被充分地离心分离之后,使红细胞和纤维蛋白充分沉淀,可以在加样时避免加入红细胞和纤维蛋白,避免这两种干扰物质对实验结果的影响,就可避免“花板"情况。

2、 高IgG血症 在实际工作中,笔者发现,检测丙肝的实验出现花板的情况较多,原因之一是因为目前国内外的抗-HCV EIA试剂均采用间接酶联免疫检测原理,间接法的一个重要影响因素是血清中所含的高浓度的非特异性IgG,IgG对聚苯乙烯有较强的吸附力,非特异性IgG可吸附到固相载体上或包被的抗原上造成假阳性。

二、 解决办法主要在洗涤

聚苯乙烯因其具有较强的吸附蛋白质的性能而被广泛用于ELISA实验的固相载体,聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,因此需要通过洗涤清除在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤,但却决定着实验的成败。上述提到的血清中存在红细胞或纤维蛋白原,可以在加样前离心时得到控制,同样也可以通过适当增加洗涤次数和浸泡时间减轻或避免对实验结果的影响,同样,对于血液存在的非特异性的IgG,实验者很难在加样时将其去除,那么解决的最佳时机就是洗涤过程。

ELISA在洗涤过程中需注意以下几点:

1、板要平整,尤其是在用洗板机洗板的过程中,往往是3排一起洗,如果板不平,就很可能造成洗液有残留,从而导致非特异性结合不能清除干净,对实验结果造成干扰。

2、洗液温度,实验表明,洗液温度也会影响洗板的干净程度,尤其是冬天温度过低时容易出现“花板"问题。因此,最好保持室温在20℃-30℃。

3、洗液要注满孔,孔壁洗涤不干净也易造成“花板"现象。

4、洗液要新鲜配置,洗液要临用前新鲜配制,放置时间过长易产生絮状物或混浊,造成赌孔或花板。

5、洗板次数不够或洗涤间隔时间过短也会造成由于洗板不净而造成“花板"。

三、 孵育时间过长也会造成“花板"

本实验室曾有一段时间经常出现丙肝检测“花板"现象,究其原因是由于样本较多,加样后未及时放入孵育箱,反应板在室温呆的时间过长,即间接增加了孵育时间,导致孵育时间过长,蛋白质非特异性吸附于固相载体。因此,应严格控制加样时间,加样后及时孵育,标本较多时可分批操作。

此外,有些厂家的试剂显色液不稳定,使用前容易变蓝,如在实验前不仔细检查,很容易导致“花板"现象的发生,这也提醒实验者应使用新鲜的显色液,很大程度的保证实验的准确性。

综上所述,将ELISA“花板"现象总结为:花板原因大多在样品,解决办法主要在洗涤,孵育和显色过程也会导致。既然原因大多在样品,那么在样品交接时应严格按照规定,无溶血,无凝血,足量,单个的溶血样品虽不致造成“花板",但血红蛋白中的血红素基团,具有类过氧化物的活性,在以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)为标记酶的ELISA测定中,易在孵育过程中吸附于固相,从而与后面加入的底物反应显色,从而造成假阳性。洗涤是ELISA的关键步骤,充分有效的洗涤也是避免“花板"的有利措施。同样,严格按照试剂说明孵育,使用新鲜的显色液也是有效避免“花板"的保障。以上措施可以有效减少“花板"次数,从而提高检测的特异性和准确性,更好的发挥ELISA的方法学优势。

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