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1、 血清的主要成分和功能

牛血清在细胞培养中对细胞的生长增殖具有重要甚至是难以替代的作用，它含有丰富的细胞生长必须的营养成分。主要有以下成分和功能：

A、 血清中的主要物质—蛋白质如白蛋白等具有缓冲细胞培养液酸碱度、维持渗透压的作用。

B、 转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白等结合蛋白，有识别维生素、脂类、金属和其它激素等，并能与有毒金属和热原质结合，从而起到解毒作用。

C、 纤维粘连素、胎牛血清中的胎球蛋白、贴壁因子等能促进细胞贴壁、铺展。

D、 多肽类如血小板促生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子、胰岛素、类胰岛素生长因子、促生长激素等能支持细胞分裂增殖并维持细胞对数生长。

E、 2巨球蛋白等蛋白酶抑制剂能抑制蛋白酶，保护细胞不受损害。

F、 血清中还含有丰富的氨基酸、葡萄糖、酮酸及与蛋白相结合状态的微量元素等，对细胞培养均有意义。

正因为血清具有如此复杂的成分和重要的功能，所以血清的保存和使用显得非常重要。

2、 保存血清的方法：

我们建议血清应保存在-15℃至-20℃，有效期为5年，若存放于4℃时，请勿超过四周，若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。不宜反复冻融。配制成*培养基后应在四周内用完。

3、 血清解冻后有絮状沉淀物出现，该如何处理：

血清中沉淀物的出现有许多种原因，zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后也会存在于血清中，也是造成沉淀物的主要原因之一，但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量，若您欲除去这些沉淀，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以直接过滤的方式去除这些沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、 如何解冻血清才不会使血清质量受损：

我们建议您将血清从冷藏箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融，但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

5、 为什么要热灭活血清：

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐您使用热灭活血清。

6、 有必要做热灭活吗：

实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数细胞而言是不需要的，经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或*没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热灭活处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，类似于“小黑点”形状，这常常会让研究者误认为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热灭活处理，如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保血清的质量！

7、 如何避免沉淀物的产生：

我们建议您在使用血清的时候，注意下列操作：

A、 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20℃至4℃至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如-20℃至37℃），实验显示非常容易产生沉淀物。

B、 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

C、 请勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，从而影响血清质量。

D、 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可无须做此步骤，若必须做血清的热灭活，请严格遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

ELISA检测样品的处理方法

通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。正确的处理样本是保证ELISA检测的正确性和准确性的*步，下面简单介绍一下不同类型的样本的处理方法。

1、  血清

血清是zui常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。

用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃GUOYE，使血清析出。（将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃ 1000×g离心20分钟，仔细收集上清。建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色，而导致检测的不准确性。同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。

2、  血浆

用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30min内4℃ 1000×g离心15min，取上清即血浆。将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。

常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。

3、  细胞培养上清

取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

4、  细胞裂解液

1）  吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。

2）  收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次。

3）  加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬。

4）  将样品放入-20℃或-80℃，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融几次，使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎，以达到裂解的目的。

5）  4℃ 10000×g 离心10min，除去细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

5、组织匀浆液

1）  将组织样本用PBS (0.01M, PH 7.4) 冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质。

2）  将组织块称重，记录后剪碎，碎块应尽量小，便于匀浆得更充分

3）  将组织按一定的比例加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中。（通常按组织重量：PBS体积=1:9的比例匀浆，例如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）

4）  吸取匀浆液到离心管，4℃ 5000×g 离心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

6、  尿液、唾液等其他液体生物样本

1000×g离心20min，取上清即可检测。

总的来说，因为ELISA只能检测可溶性蛋白的含量，所以应保证所有样本均为澄清的液体，沉淀或悬浮物都应离心去除。

为了保证检测的准确性，保存于-20℃或-80℃的样本在1~6个月内检测；4℃保存的样本应在1周内进行检测。

另外，还应保证样本不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性的结果。